Глава 7. Структурное оформление процессов обмена

1. Наблюдения на уровне светового микроскопа и методом центрифугирования

Принципиальное отличие метаболических процессов в живой клетке от реакций, с которыми имеют дело в синтетической химии, состоит в том, что метаболизм живых существ протекает на базе клеточных структур. Кроме того, биологические синтезы в основном являются матричными, в частности синтезы всех видов белков, протекающие на матрицах информационной РНК, синтез которой возможен только на базе соответствующей клеточной структуры. Клетка сравнима со сложнейшей системой цехов со сменой контейнеров с органическими и водными средами и разнообразными адсорбентами. Такая структура обеспечивает необходимую последовательность в работе сложнейшей системы согласованно протекающих реакций обмена веществ, структурная база которого изучена еще далеко не достаточно.

Сведения о морфологии клетки накоплены уже давно, однако функции клеточных структур начали раскрываться только в последние два-три десятилетия, когда было обнаружено значение структурированных матриц, с одной стороны, и разделов сред, т. е. мембран, для протекания синтетических процессов, - с другой. Уже давно было замечено, что в растворах очищенных ферментов скорость синтезов протекает медленнее, чем в клетке. Так зимаза Бюхнера, будучи изолированной из дрожжей, сбраживает сахар с образованием спирта гораздо менее интенсивно, чем живые и убитые высушиванием дрожжи (Zalokar, 1965).

Клеточные структуры обеспечивают определенный порядок следования метаболических реакций, который при их распаде нарушается, и эффект начинают проявлять только гидролитические энзимы. Для изучения функций тех или иных клеточных структур очень важно сохранить их в нативном, не разрушенном фиксацией или гомогенизацией состоянии, для чего существуют два метода, удовлетворяющие этому требованию: 1) метод прижизненных окрасок, включая люминесцентную микроскопию (Мейсель, 1950); 2) метод прижизненного центрифугирования гиф и последующего проявления преобладающих в разных структурах функциональных групп или энзимов (Zolokar, 1965). Определенную помощь в понимании морфологии клеточных структур дает электронная микроскопия, а в их функциях - анализ фракций после ультрацентрифугирования гомогенатов клеток. Однако и тот и другой метод не лишены недостатков, поскольку один может приводить к артефактам при фиксации, а другой к - механическому разрушению многих структур при гомогенизации.

Метод субтоксических концентраций флуоресцирующих красителей для выявления клеточных структур на уровне оптической микроскопии был впервые широко использован Мейселем (1950), получившим специфическое прижизненное окрашивание клеточных органелл дрожжей. Он использовал в этих целях берберин-сульфат, окрашивающий митохондрии и ядра в желтый цвет; акридиноранж (ядра - зеленые, гранулы волютина - красные); нейтральрот (вакуоли - желтые, гранулы волютина - красные) и аурофосфин (ядра - зеленые, гранулы волютина - красные, митохондрии - желтые). Янус грюн окрашивает митохондрии в различные оттенки сине-зеленого (при высоком rh) до розового цвета (при низком rН), что зависит от окислительно-восстановительного режима митохондрий.

Сочетание метода центрифугирования гомогенатов клеток с витальными наблюдениями и микроскопическим контролем полученных фракций весьма полезно для выяснения функций клеточных, органелл.

В изучении тонкой структуры клеточных органелл незаменимым является электронно-микроскопическое исследование, с помощью которого различают основные клеточные структуры грибов: мембрану, структуры цитоплазматической сети, включая микросомы и рибосомы, митохондрии, специализированные клеточные органеллы и ядра.