Глава 4. Азотное питание грибов. Функция соединений азота в мицелии грибов и их биосинтез

1. Азотное питание грибов

По сравнению с фотосинтезирующими организмами в мицелии грибов азота намного больше и азотный обмен у них сильно развит, хотя по объему затрачиваемого на него материала уступает углеродному. Азота в мицелии грибов содержится в 5-6 раз меньше углерода. Однако в питательных средах приходится поддерживать соотношение C/N порядка 40/1 (например, в среде Чапека), что объясняется использованием соединений углерода в качестве источника энергии. Вследствие этого углерод в сравнительно небольшой степени удерживается мицелием, тогда как азот, за немногими исключениями, когда его соединения служат источниками энергии (окисление аммиака или переработка дезаминированных аминокислот), остается в нем целиком.

Азот у грибов входит в состав оболочки (в хитин и хитозан), в белки, пептиды и аминокислоты, в витамины, в большую часть кофакторов и в белковую часть ферментов, в пурины и пиримидины, т. е. в основания нуклеиновых кислот.

По характеру их питания азотом Роббинс делит грибы на четыре группы, использующие:

1) органический азот, NH₃, NО₃^- и N₂ (т. е. газообразный азот атмосферы);

2) органический азот, NH₃ и NO₃^-;

3) органический азот и NH₃;

4) только органические соединения азота.

Усвоение атмосферного азота грибами. По имеющимся в научной литературе данным, усваивать атмосферный азот способна? сравнительно узкая таксономическая группа грибов, образующих эндотрофную микоризу, относящаяся к родам Phoma (у вересковых растений) и Rhizoctonia или Orcheomyces (у орхидных - Neottia nidus avis и других).

Первые данные по фиксации азота у Phoma betae были получены в 1901 г. Сайда. Далее более детально этот вопрос был изучен в 1907 г. Тернетцем, который установил эту способность имеющимися в то время в его распоряжении методами для пяти: разновидностей Phoma radicis, представляющих собой симбионтов брусники, клюквы, вереска, подбела и Tetralicus. К подобным, содержащим эндотрофную микоризу из рода Phoma, растениям можно, видимо, сейчас отнести также рододендрон, багульник и пустынный кустарник казуарину.

Усвоение азота у трех разновидностей Phoma по данным Тернетца, оказалось не уступающим Azotobacter, и составляло от 10,92 до 22,14 мг азота на 1 г использованной глюкозы, при параллельно испытанной энергии усвоения атмосферного азота у Azotobacter порядка 10,66 мг азота на 1 г глюкозы. Позднее доказывалось усвоение азота атмосферы у Phoma casuarinae, причем в этих целях был использован меченый азот при выращивании этого организма на синтетической среде с сахарозой в атмосфере газовой смеси, содержащей кислород и изотоп азота ¹⁵N₂. Более поздние опыты с этой культурой не подтвердили предшествовавших данных, поскольку, по-видимому, они проводились с долго поддерживавшимся в искусственной культуре штаммом, который мог утратить способность усваивать азот.

У Orcheomyces (или Rhizoctonia), симбионта орхидных, усвоение азота оказалось близким по объему к Azotobacter (9,8-13,3 мг на 1 г усвоенной глюкозы), но для этого организма доказательства усвоения им азота менее убедительны. В последнее время есть сведения об усвоении атмосферного азота грибами из родов Rhodotorula и Pullularia (Nicholas, 1965). Анализ этой способности у образователей эктотрофных микориз из числа базидиомицетов привел к отрицательным результатам.

Вопрос об усвоении грибами атмосферного азота еще недостаточно изучен и окончательно не решен. Однако с точки зрения их экологии вряд ли можно сомневаться, что эта способность им присуща, в частности всем эндотрофным микоризам вересковых и многих других растений, характерных для примитивных северных, высокогорных и пустынных почв и бедных азотом торфяных формаций болот. Иначе нельзя было бы объяснить возможность существования в этих условиях порой очень мощной растительности (например, лиственничной тайги) в обстановке полного отсутствия бобовых растений и не выносящего кислого рН подзолистой и заболоченной почвы азотобактера. Все подлески таких растительных формаций состоят обычно из содержащих микоризу из рода Phoma вересковых: рододендрона, голубики, черники, брусники или багульника и клюквы. Взаимоотношения видов Phoma с их растениями-хозяевами, видимо, сходны со взаимоотношениями бобовых растений и клубеньковых бактерий из рода Rhizobium.

Усвоение нитратного азота грибами. Большая часть грибов способна утилизировать ион NO₃^- как единственный источник азота. До 90% грибов усваивают ионы NO₃^- и NO₂^-, так как содержат систему ферментов, называемую нитратредуктазой. К их числу, например, принадлежит Aspergillus niger (Терентьева, 1966) или Fusarium oxysporum (Said, Harhash, 1966). He усваивают нитраты только некоторые Saprolegniaceae (исключением из числа которых является использующая их Apodachlya brachynema), а также Blastocladiales и некоторые высшие базидиомицеты. У них система нитратредуктаз, видимо, отсутствует.

Поскольку эта система является чаще адаптивной и развивается после определенной лаг-фазы, правильнее испытывать способность грибов к усвоению нитратов уже на заранее выращенном мицелии, отмывая его от первоначальной питательной среды перед переносом в среду с нитратами (Nicholas, 1965). Тогда количество усваиваемого NO₃^--иона может сильно увеличиться. На первое этапе усвоения иона NО₃^- происходит его восстановление в ион NO₂^-, который в аэробных условиях может накапливаться в среде в концентрациях до 10^-3-10^-2 моль/л и проявлять токсический эффект, мешающий дальнейшему усвоению нитрата (Walker, Nicholas, 1961). Например, рост Neurospora crassa ингибируется при достижении концентрацией NaNО₂ уровня 1⋅10^-3 моль/л и выше, что сопровождается накоплением нитрита в мицелии. Подобное же наблюдалось и у дрожжей.

Существуют виды грибов, усваивающие ион NO₃^- лучше, чем ион NH₄⁺, например Alternaria poonensis. Не усваивает NO₃^--ион Penicillium ammoniophylum, описанный Шапошниковым и Мантейфель, и плохо усваивает ряд мукоровых грибов, среди которых находятся Phycomyces blakesleeanus, Rhizopus nigricans, Zygorhynchus moelleri, виды Absidia и Mucor. Из числа базидиомицетоа слабо усваивают нитраты виды Marasmius, Lenzites trabea, Pleurotus ostreatus и ряд других.

Усвоение грибами нитритов. Грибы более толерантны к иону азотистой кислоты, чем бактерии, что связано с их способностью переносить низкие значения рН. Большая часть видов грибов, усваивающих нитраты, усваивает и нитриты, если этому не препятствует токсичность HNO₂, как в случае дрожжей и растущей в кислой среде Cereospora (Thind, Mandahar, 1965). Ион NO₂^- менее токсичен, чем сама азотистая кислота (HNO₂), поэтому в нейтральных средах усвоение этого источника азота усиливается. Хорошо используют нитрит Fusarium niveum, Phymatotrichum omnivorum, Scopulariopsis brevicaulis, Coprinus sp., Rhizophlyctis rosea.

У Scopulariopsis brevicaulis скорость усвоения нитрита соизмерима со скоростью усвоения нитрата и иона аммония, а именно составляет 1,2 мг азота на 1 г массы сухого мицелия в час. При добавке иона NH₄⁺ в культуру S. brevicaulis, выросшего ига среде с нитритом, усвоение последнего практически не подавляется и он используется параллельно иону аммония, т. е. этот гриб не утрачивает своей адаптации к нитриту. Наоборот, при добавке иона NO₂^- в культуру, выросшую на среде с аммонийным источником азота, азотистая кислота почти не используется, а ассимиляция иона NH₄⁺ подавляется в течение двух суток, после чего оба иона используются с одинаковой скоростью. Эти эксперименты подтверждают адаптивность системы нитрат- и нитритредуктазы.

Усвоение иона аммония. Обычно слабо усваивают нитраты и хорошо ион аммония зигомицеты, ряд базидиомицетов и дрожжи. Барьер клеточной мембраны аммоний обычно преодолевает в форме недиссоциированного аммиака. Скорость проникновения соответствует градиенту его концентраций по обе стороны клеточной мембраны и скорости его потребления на биосинтез. Ход потребления аммония у грибов, например у Penicillium griseofulvum и Fusarium graminearum, сходен и протекает быстрее при более высоком рН среды. Однако одновременно усвоение аммиака происходит тем быстрее, чем ниже внутриклеточное рН. Например, у F. graminearum и Aspergillus niger с их более низким рН внутри клетки оно происходит интенсивнее, чем у S. brevicaulis (Nicholas, 1965).

Усвоение азота сильно зависит от источника и объема углеродного питания. Так, при наличии слабо используемых источников углерода и NН₄⁺-иона, в качестве источника азота возможна интоксикация мицелия аммиаком. Такой случай наблюдается у Муrothecium verrucaria, рост которого в подобном сочетании угнетался даже в присутствии иона NO₃^-. Однако при добавке глюкозы он хорошо рос на винно-кислом аммонии или в сочетании сернокислого аммония с органическими кислотами. Сходные явления были обнаружены у S. brevicaulis (Morton, McMillan, 1954/табл. 4.1).

Таблица 4.1. Рост мицелия и ассимиляция азота у Scopalariopsls brevicaulis, (Morton, McMillan, 1954)

Подобный эффект органических кислот состоит в связывании поступающего в клетку аммиака, регуляции рН клетки и облегчении включения аммиака в аминокислоты.

Использование грибами смешанных источников азота. Общим явлением у грибов оказывается подавление ассимиляции иона нитрата при одновременном введении в среду иона аммония, тогда как введение иона NO₃^- не подавляет ассимиляции аммиака (Morton, McMillan, 1954).

В этом отношении сходно ведут себя такие виды, как Scopulariopsis brevicaulis, Alternaria solaniy Aspergillus repens, Botrytis allii, Cladosporium herbarum, Diplodia natalensis, Mucor rammanianus, Trichoderma viride, Myrothecium verrucaria и Penicillium chrysogenum. Некоторые виды, к числу которых относятся Aspergillus niger, A. oryzae, Fusarium graminearum и Penicillium griseofulvum, способны использовать ионы нитрата и аммония одновременно (Nicholas, 1965).

При неравномерном использовании ионов из вносимых в среду солей, как в вышеприведенных случаях с Myrothecium verrucaria, Scopulariopsis brevicaulis, а также с культурой Piricularia oryzaef вследствие более быстрого использования источника азота в форме NH₄⁺-иона из сернокислого аммония, среда сильно подкисляется за счет остающегося в ней в избытке иона SО₄^2-. В результате этого может тормозиться рост гриба. Однако в случае Piricularia oryzaey рост может быть восстановлен при добавке в среду солей органических кислот как источник углерода, аммонийных солей (например, (NH₄)₂HPО₄) или нейтрализующего среду мела. Стабилизацией рН среды объясняют также благоприятное действие на усвоение иона NH₄⁺ у Aspergillus сукцината. При его потреблении происходит нейтрализация среды (Agnihotri, 1966).

Использование смешанных источников азота, например аммонийной селитры (NH₄NО₃), значительно зависит от рН среды. Aspergillus niger при рН более 3,0 усваивает в первую очередь ион аммония, в более кислой среде преимущественно переходит к иону нитрата. Порог рН, равный 3,0, близко подходит к уровню изоэлектрической точки (ИЭТ) белка мицелия A. niger, т. е. к точке равновесной диссоциации анионов и катионов белка цитоплазмы. При рН ниже ИЭТ белок диссоциирует с избытком катионов, при рН выше ИЭТ - с избытком анионов. Поэтому в первом случае происходит преимущественная адсорбция белком цитоплазмы анионов, а во втором - катионов. Бюннинг и Роббинс продемонстрировали эти явления у грибов на модели адсорбции ими базофильных и ацидофильных красителей, имеющих соответственно окрашивающую часть молекулы в форме аниона или катиона, объяснив таким образом механизм преимущественного использования ионов в зависимости от рН среды и уровня ИЭТ и белков цитоплазмы.

Эффект органических кислот в отношении облегчения усвоения аммиака сводится не только к его нейтрализации при поступлении в клетку. Вторая роль их состоит в облегчении включения его в аминокислоты путем трансформации их в соответствующие кетокислоты. Поэтому в основном усвоению иона NH₄⁺ способствуют органические кислоты с четырьмя атомами углерода, как янтарная, фумаровая и винная, трансформирующиеся в аспарагиновую кислоту, а также с двумя и тремя атомами углерода, как молочная, пировиноградная и уксусная, дающие начало аланину и глицину. Применяют их в среде в концентрациях порядка 0,1-0,2%. Примером этого может служить благоприятное действие на усвоение иона аммония фумаровой кислоты у базидиомицетов и винной - у Chaetomium globosum.